什么能影响白癜风患者黑色素的合成

　　在白癜风患者色素化皮肤类似物中黑素瘤细胞所处的环境更接近体内，但由于构建操作复杂，而黑素瘤细胞与角质形成细胞混合培养模型的构建所需时间短， 操作相对简单，但白消一号方显示比较明显的促进黑素瘤细胞增殖的作用。

　　1. 白癜风患者黑素瘤细胞与角质形成细胞混合培养模型的建立

　　常规培养黑素瘤细胞、角质形成细胞。取第三代生长状态良好的黑素瘤细胞、角质形成细胞消化、离心，细胞计数后以含10%胎牛血清的DMEM培养基里将两种细胞悬液混合， 调整细胞浓度，使黑素瘤细胞与角质形成细胞接种比例为1∶10。37℃，5%CO2孵箱内培养， 同时倒置显微镜下观察细胞接种后的生长状况。

　　2.大鼠黑素细胞含药血清的制备

　　30 只大鼠，禁食12 h后，分别灌胃给药，按每公斤体重3 mL 原液(30 g生药)相当于临床成人用量10 倍(折合成生药约15g / kg);对照组灌等量生理盐水。给药方法为每日1次，连续给15 d。分别设5 个采血时相，即末次给药后30 min，60 min，120 min，180 min，300 min 无菌条件下采血; 采血方法采用心脏取血( 无菌操作)，防止溶血，37℃促凝，2 500 r / min 离心后取透明、清亮、淡黄色，无沉淀血清，0.22 μm 微孔滤膜除菌，-20℃保存备用。

　　3.含药血清对黑素细胞增殖的影响

　　将培养细胞每孔2×105 接种至96 孔板，各时间组设6 个复孔，80 μL 培养液中加入20 μL 含药血清，以给药前大鼠血清为对照，5%CO2，37℃培养箱培养72 h。MTT 配成5 mg /mL，每孔加入20 μL，置培养箱4 h后，吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，将培养板至于微孔板震荡器震荡10 min，使结晶溶解。酶标仪490 nm 测定吸光度的值[6-8]。黑素细胞增殖率=(A490 含白癜风的早期症状药血清-A490 空白) / (A490 加药前-A490空白对照)×100%。

　　4. 白癜风患者黑素细胞酪氨酸酶活性测定

　　将细胞浓度调整为4×104 /mL， 接种于96 孔细胞培养板80 μL 培养液中加入20 μL 含药血清。继续培养48 h 后弃培养基，用pH7.4 的PBS 洗涤2 次，每孔加10 mL / L 的TritonX-100 溶液90 μL，震荡5 min 溶解细胞，每孔加入10 μL 0.1%L-DOPA，37℃孵育30 min 后于490nm 波长处测吸光度A。酪氨酸酶激活率=(A 含药-A 空白孔) / (A 对照-A 空白孔)×100%。

　　5. 黑素含量测定

　　白癜风患者黑素瘤细胞黑素含量的测定：将细胞浓度调整为1×105 /mL，加入96 孔细胞培养板上，24 h 换液，每孔加入培养液1.8 mL，含药血清0.2 mL。培养48 h 后弃去上清液，用生理盐水洗涤细胞，每次2 mL，洗2 次。每孔加入0.25%胰蛋白酶消化3 min，加适量培养液吹打细胞至混悬状，收集细胞至离心管中，800 r /min 离心。吸出上清液，沉淀加10%三氯乙酸2 mL，1 200 r /min 离心，小心倾去上清液。再加入1 mL 1 mol / L 的NaOH 0.5 mL 震荡5 min，490 nm 酶标仪检测A 值。